• CRISPR/Cas9基因编辑
  • 免疫组库测序
  • 转录组测序
  • 甲基化检测
  • 微生物鉴定
  • CRISPR/Cas9   

    一、CRISPR/Cas9基因编辑系统:简便而强大的基因编辑工具

    CRISPR(clustered, regularly inter spaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制,由单链gRNA(Guide RNA)介导的Cas9核酸酶对靶基因的DNA序列进行定向改造的技术。与锌指核酸酶(ZNF)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)技术相比,能够实现相似甚至更加高效且特异性的基因敲除,敲入及定点修饰等功能。除了这些基础编辑方式外,该系统还可以被用于基因激活,疾病模型构建,甚至是基因治疗。


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    二、服务价格及周期:

    服务项目

    服务价格

    服务周期

    sgRNA设计

    询价

    2个工作日

    sgRNA表达载体构建

    询价

    1-2

    CRISPR-Cas9系统活性检测

    询价

    2-3

    CRISPR-Cas9慢病毒包装及稳定细胞株构建

    询价

    5-6

    sgRNA全基因组文库构建

    询价

    6-8

    小动物基因敲除服务

    询价

    4-5个月

    1. sgRNA设计:快速全面

    针对目前sgRNA的在线设计网站存在的不足,艾克韦生物及时推出了本地化运行sgRNA软件设计服务,2个工作日内可给出sgRNA设计结果,包括详细的off-target数据,且不限物种,提高科研工作效率!

    服务周期:2个工作日

    2. sgRNA表达载体构建:简便快捷

    只需针对需要编辑的DNA序列合成一段具有PAM识别位点的DNA序列,插入带有入核信号的表达载体的特定部位。连同表达cas9蛋白的载体转入宿主细胞后,产生的人工构建的gRNA就能指导Cas9蛋白切割宿主细胞特定的DNA序列,从而起到基因编辑的作用。

    服务周期:1-2

      

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    3. CRISPR-Cas9系统活性检测:精准特异

    不同的gRNA介导的Cas9DNA的切割效率不一致,因此在利用CRISPR-Cas9建立基因敲除或敲入动物前需要先对gRNA进行活性验证,选取更高切割效率的gRNA

    艾克韦生物提供三种gRNA活性检测方法——SSA活性检测、体外切割活性验证和内源性活性切割。

    服务周期:2-3                                                     

    4. CRISPR-Cas9慢病毒包装及稳定细胞株构建:高效率

    艾克韦生物慢病毒包装服务可提供慢病毒表达Cas9/Cas9 Nicknase蛋白以及稳定表达的Cas9蛋白细胞株,可提高Cas9转入效率并在宿主细胞中稳定表达,将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而保证CRISPR-Cas9系统具有更高的基因编辑效率。

    服务周期:5-6

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    4 CRISPR-Cas9慢病毒包装及稳定细胞株构建流程


    5. sgRNA全基因组文库构建:定制化

    基因组范围的CRISPR 敲除(GeCKO)文库是gRNA的混合文库,可以在人或小鼠的基因组内敲除任何表达基因及非表达的基因,已经被广泛使用于原代的人或小鼠细胞,干细胞,癌细胞及各种稳定细胞系。

    艾克韦生物可为客户定制针对特定基因分类的gRNA文库(lncRNA 文库、细胞凋亡、细胞增殖、信号通路、离子通道、核受体相关等文库)。

    服务周期:6-8

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    5 sgRNA全基因组文库构建服务流程

     

    6. 小动物基因敲除服务:一站式快速构建

    艾克韦生物具有完整的CRISPR-Cas9设计、合成及应用平台,以及丰富的CRISPR-Cas9基因敲除实践经验,可提供小动物基因敲除的全套解决方案,人为的构建相应的动物病理模型,从而观察疾病的发生和发展规律,得到科学准确的数据。只需要几周时间即可完成基因修饰小鼠的构建,大大缩短了实验周期,为后续实验顺利进行提供了保证。

    服务周期:4-5个月

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    6 动物CRISPR-Cas9基因敲除流程


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    一.免疫组库介绍

    人体微环境内负责保卫机体的免疫细胞主要有T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞等,这些专职免疫细胞具有独特的结构和功能,并含有独特的免疫细胞亚群和功能分子。TB细胞是人体主要的淋巴细胞,分别负责细胞免疫和体液免疫,T细胞受体(TCR)和B细胞受体(BCR)由多条肽链组成,具有抗原结合特异性,每条肽链的互补决定区(CDR,又称超变区)氨基酸组成和排列顺序呈现高度多样性,构成容量巨大的TCRBCR库,据推测,TCR的多样性可达到1016BCR的多样性可达到1011,研究表明亚型越多,越能有效抵抗细菌、病毒等病原体侵袭,人体内免疫细胞的多样性和人的健康状态以及疾病的发生密切相关。目前新兴的免疫组库研究重点就集中在研究CDR区域的多样性上。

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    TCR多样性产生原因图示

     

    免疫组库 (Immune repertoire, IR) 是指在任何时间、某个个体的所有功能多样性B细胞和 T 细胞的总和。免疫组库技术以T/B淋巴细胞为研究目标,以多重PCR5’RACE技术目的扩增决定B细胞受体或T细胞受体多样性的互补决定区(CDR3),再结合高通量测序技术,全面评估免疫系统的多样性。通过对机体的高通量的免疫大数据的进行分析挖掘,找出疾病相关特异性序列克隆,对疾病的早期诊断和预防提供参考;同时还能为伴随治疗,免疫治疗和单克隆抗体的制备等以精准医疗(Precision Medical)为导向的治疗策略带来革命性的改变。

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    5’RACE                                                     多重PCR

     


    免疫组库拥有广阔的应用领域,可提供个体某一特定时期完整的多样性信息,探究抗体与TCR在适应性免疫过程中的变化。使得免疫组库在疫苗和医药的发展、生物标志物的发现、最小残余疾病检测、自身免疫性疾病的研究以及移植后监测等都具有应用价值。

    所得免疫组数据可进行以下用途:



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    二.艾克韦生物提供的服务:

    艾克韦生物具有完整的免疫组库测序应用平台,丰富的免疫组库操作实践经验,资深的信息解读专家,可提供全套免疫组库服务,利用独特的扩增子拯救技术,可以快速、高效、高覆盖度、无偏差的构建文库。艾克韦生物提供包括从样本处理建库测序数据整理和分析等一系列的全套服务。

    1. 样本核酸的提取;

    2. 免疫组建库;

    3. PCR产物纯化及定量;

    4. 二代测序;

    5. 数据分析。

    5.1 基本数据过滤和统计

    5.2 Reads比对与组装

    5.3 免疫组库多样性分析

    CDR3序列结构分析

    1)分析CDR序列组成及序列碱基成分

    2)分析CDR序列的碱基插入和缺失

    3)编码CDR序列翻译成氨基酸和肽链绘制V/J基因表达图谱

    5.4差异分析

    样品间多样性差异分析(辛普森系数、香农威纳系数)

    样品间克隆表达差异分析(CDR3V-D-J

    分组样品间的克隆表达差异分析(CDR3V-D-J


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    三.样品要求

    1. 所提供样品可以是血液、组织,也可以是已经提取好的核酸序列。

    2. RNA 样品:最低0.5ug,建议送样1.5ug,浓度>200ng/ulOD260/OD280介于1.8~2.20之间,OD260/230>2.0,28S:18S≥1.0,确保RNA无降解;

    3. gDNA样品:最低1.5ug,推荐3ug

    4. PBMC样本:至少需要106个细胞,建议5ml,注意不要用肝素抗凝剂,其他按照常规操作即可;

    5. 对于分选细胞,应保证在106个细胞;

    6. 对于组织样本,需保证样本新鲜或是液氮保存。

    .交付内容

    产生不低于合同规定的clean data;以及相应的数据分析结果。

    .项目执行周期

    标准流程下,从接受样本到结果分析约40个工作日。

    具体可咨询公司技术人员


  •     

    简要介绍

    转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和,主要包括 mRNA和非编码RNA 。转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点,通过新一代高通量测序,能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息,已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。


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    一.有参转录组测序

     

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    1. 样品要求

    组织样品 

           1.动物组织:>2g 

           2.植物组织:>4g 

           3.细胞培养:>1*107 

           4.血液样品:≥2ml 

     

    RNA样品 

           1.请提供浓度≥50ng/μL,总量≥2μg的RNA(单次建库用量为1μg),对于总量≥10ng的样本可以采用微量建库 

           2.OD260/ 280介于1.8 ~ 2.2之间,OD260/230≥2.0,RIN值≥6.5,28S:18S≥1.0,确保RNA无降解 

           3.送样时请标记清楚样品编号,管口使用Parafilm膜密封 

           4.样品保存期间切忌反复冻融 

           5.送样时请使用干冰运输 

     

    cDNA样品 

           1.样品需求量(单次):建议送样量≥2μg,对于总量≥500ng的样本可以采用风险建库 

           2.样品浓度: 最低10ng/μL 

           3.样品纯度:OD260/280介于1.80-2.00之间,RIN值≥6.5 

           4.样品保存期间切忌反复冻融,送样时请使用干冰运输 

     

    实验周期 

           1.样品制备:5个工作日完成RNA抽提及质检工作,将质检报告发送给甲方,待甲方确认后开始正式实验。(时间视具体样品数量及特点而定) 

           2. Illumina HiSeq测序:乙方在获得甲方确认及收到预付款后25个工作日内完成测序工作。 

           3.生物信息学分析:乙方在测序工作完成后25-35个工作日完成标准生物信息学分析。10-20个工作日完成高级生物信息学分析。(视具体工作量而定) 

    组织样品 

    1动物组织:>2g 

            2植物组织:>4g 

            3)细胞培养:>1*107 

            4血液样品:≥2ml 

    RNA样品

    1请提供浓度≥50ng/μL,总量≥2μgRNA(单次建库用量为1μg),对于总量≥10ng的样本可以采用微量建库

    2 OD260/ 280介于1.8 ~ 2.2之间,OD260/230≥2.0RIN≥6.528S:18S≥1.0,确保RNA无降解

    3送样时请标记清楚样品编号,管口使用Parafilm膜密封 

            4样品保存期间切忌反复冻融 

            5送样时请使用干冰运输

    cDNA样品

    1样品需求量(单次):建议送样量≥2μg,对于总量≥500ng的样本可以采用风险建库 

    2样品浓度: 最低10ng/μL 

    3样品纯度:OD260/280介于1.80-2.00之间,RIN≥6.5 

    4样品保存期间切忌反复冻融,送样时请使用干冰运输 

    2. 实验周期 

    1样品制备5个工作日完成RNA抽提及质检工作,将质检报告发送给甲方,待甲方确认后开始正式实验。(时间视具体样品数量及特点而定)

    2 Illumina HiSeq测序:乙方在获得甲方确认及收到预付款后25个工作日内完成测序工作。

    3生物信息学分析:乙方在测序工作完成后25-35个工作日完成标准生物信息学分析。10-20个工作日完成高级生物信息学分析。(视具体工作量而定)

    3常见问题

    1如何确定研究物种有无参考基因组?

    根据所研究物种的拉丁文名,可在Ensemblhttp://asia.ensembl.org/index.htmlJGI(http://genome.jgi-psf.org/ )NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索是否有该物种的基因组信息, 也可在其他专门介绍某种物种的网站寻找参考基因组。

    2是否一定要求设置生物学重复,以及重复次数?

    目前没有生物学重复的实验发文章比较困难,尤其是IF≥5的杂志。文章投出之后,容易遭编辑质疑。如果确实受限于研究经费,无法设置生物学重复。那就要结合强有力的实验数据做支撑,比如定量实验、 FISH荧光原位杂交或Northern blot等,用实验数据说服编辑。重复设置原则上越多越好,但考虑到现实条件,重复设置≥3。一般不建议设置两个重复,因为如果两者结果不一致,我们无法确定以哪个数据为参考。 

    3多个样品的转录组,如何确定是将所有样品一起拼接还是每个样品分开拼接? 

     样品分开拼接的情况,一般适用于不同的物种,同一属不同的种或者同一物种不同的品系。通过分析同源基因受选择压力情况从而鉴定亲缘关系。

     同一物种不同个体的混样,或者同一个体不同组织部位,发育阶段样品建议一起拼接能够得到该物种更全的转录组数据。

    4真核生物以转录组de novo结果作为reference进行表达谱测序是否可行?

    可以的,但是因为转录组具有时空和组织特异性,需要保证表达谱测序样本要包含在转录组测序中,否则此reference没有意义。

    4. 艾克韦生物优势

    1任意物种的全转录组分析:无需预先设计特异性探针,因此无需了解物种基因或基因组信息,能够直接对任何物种进行最全面的转录组分析;

    2拥有Illumina HiSeq 2500HiSeq 4000MiSeq等多种高通量测序平台;

    3拥有专业的生物信息团队和大型计算机,可以为合作伙伴提供个性化的生物信息分析服务;

    4分辨率高:可以检测基因家族中相似基因及可变剪接造成的单碱基差异;

    5检测范围广:从几个到数十万个拷贝精确计数,可同时鉴定及定量正常和稀有的转录本。

     

     

    二.Small RNA 测序

        Small RNA是生命活动重要的调控因子,短小的序列长度(如microRNA一般在18-30nt之间);种类繁多, siRNA(小干扰RNA ), microRNA(微小RNA),还有其他一些种类的小RNA,如piRNA(蛋白互作小RNA),snRNA(小核RNA),snoRNA(核仁小RNA)等种类;几乎存在于所有的生物体中;在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等过程中发挥着重要作用。



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    1. 技术内容


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    2. 样品要求

    1样品类型:真核生物、原核生物;完整且无污染的总RNA;血清血浆FFPE样品

    2样品需求量(单次):≥1 μg;血清血浆:20ngFFPE200ng

    3样品浓度:15 ng/μL≤c≤500 ng/μL

    4样品纯度:OD260/280 =1.8~2.2OD260/230≥2.028S:18S≥1.5RIN≥8.023S:16S≥1.5 (此项要求只针对原核生物)。

    3.常见问题

    1 RNA 测序对样品有什么要求?

        答:请提供浓度≥200 ng/pL、质量≥10μg 的总 RNA 样品。提取总 RNA 时请避免使用过柱法和 LiCI 沉淀,以防止小 RNA 丢失。样品在收取后,将使用 Agilent 2100 检测仪和电泳等方法对总 RNA 样品的各项指标进行检测。建议在送样前,先使用 OD 值检测和电泳等方法对样品进行初步检测。
    2为什么说原始数据中存在 3’接头序列、5’接头序列污染是正常的?
        答:新一代高通量测序产生的序列长度为 35 nt,而 small RNA 序列长度是 18-30 nt,故测序得到的序列上有一段 3’接头序列。污染指的是 5’接头分子,由于加接头时接头分子都是过量加入的,因此会有空载现象,造成数据中含有少量的 5’接头序列污染。通常污染的比例会低于 570,属于正常现象。
    3进行小 RNA 测序时,客户除了样品以外还需要提供哪些相关信息? 
        答:需要提供相应物种的基因组和相关的 exonintronrepeat 信息。如果没有本物种的基因组,需要提供近缘物种的相关信息。
    4为什么实验结果中会存在降解的 mRNA 序列? 
        答:由于 total RNA 常发生轻微的降解,而生物体内也有自然的降解过程,因此数据中就会含有小部分 mRNA 降解片段。但通常这个比例很低,并且取决于样品 total RNA 的质量。

    4.技术优势

    1通量高:一次测序得到500万条以上的序列;

    2分辨率高:可以检测小 RNA单个碱基的差异;

    3精准度高:从几个到数十万个拷贝精确计数;

    4不依赖已知信息:既能鉴定已知小RNA,又能发现新小RNA

    5可重复性高:深度测序保证了抽样随机性,重复性非常好,无需重复实验。


     

    三.LncRNA测序

         lncRNAlong noncoding RNA)是一类长度超过200nt的长链非编码RNA,通过与DNARNA或蛋白质结合, 在表观遗传、转录及转录后等水平调控基因表达。艾克韦生物推出的lncRNA测序服务,使用高通量测序技术结合先进的生物信息学分析,一次性获得样本中几乎全部的lncRNAs信息,为您全面、深入地研究lncRNAs的功能提供了全新的工具。


    1.技术内容


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    2.样品要求

    样品类型:物种-人;完整且无污染的总RNAFFPE样品;

    1样品需求量:≥200ng

    2样品浓度:C≥20ng/μL

    3样品纯度:RIN≥7.0 , 28S/18S≥1.0

    3.技术优势

    1技术稳定,建库重复性好:同一样本重复建库相关性Pearson值大于0.993

    2基于高通量测序技术,可一次性获得样本中几乎全部的lncRNA信息;

    3不局限于对已知lncRNA的研究,还可进行novel lncRNA的预测;

    4除人和鼠外,还可应用于其他真核物种,可共同制定定制化研究方案

    4.常见问题

    1 RNA 测序对样品有什么要求? 
        答:请提供浓度≥200 ng/pL、质量≥10μg 的总 RNA 样品。提取总 RNA 时请避免使用过柱法和 LiCI 沉淀,以防止小 RNA 丢失。样品在收取后,将使用 Agilent 2100 检测仪和电泳等方法对总 RNA 样品的各项指标进行检测。建议在送样前,先使用 OD 值检测和电泳等方法对样品进行初步检测。
    2为什么说原始数据中存在 3’接头序列、5’接头序列污染是正常的?
        答:新一代高通量测序产生的序列长度为 35 nt,而 small RNA 序列长度是 18-30 nt,故测序得到的序列上有一段 3’接头序列。污染指的是 5’接头分子,由于加接头时接头分子都是过量加入的,因此会有空载现象,造成数据中含有少量的 5’接头序列污染。通常污染的比例会低于 570,属于正常现象。
    3进行小 RNA 测序时,客户除了样品以外还需要提供哪些相关信息?
        答:需要提供相应物种的基因组和相关的 exonintronrepeat 信息。如果没有本物种的基因组,需要提供近缘物种的相关信息。
    4为什么实验结果中会存在降解的 mRNA 序列?
        答:由于 total RNA 常发生轻微的降解,而生物体内也有自然的降解过程,因此数据中就会含有小部分 mRNA 降解片段。但通常这个比例很低,并且取决于样品 total RNA 的质量。



  • 全基因组甲基化测序

    Whole Genome Bisulfite SequencingWGBS简介:

    DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,在维持正常细胞功能、遗传印记胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要的作用。亚硫酸氢盐处理可以使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,PCR扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。对 PCR产物进行高通量测序,与参考序列比对,即可判断CpG/CHG/CHH位点是否发生甲基化。

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    二.技术流程


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    三.样品要求

    1. 每个样品所需DNA量:浓度≥50ng/μl,总量大于4μg的基因组DNA,并确保DNA无降解,无污染,OD260/280 = 1.8~2.0

    2. 样品保存期间切忌反复冻融,送样时请使用冰袋或干冰运输。

    四.技术优势

    1. 精准度高:能查看大多数物种基因组中几乎每个胞嘧啶的甲基化;

    2. 重复性好:多样本的覆盖区域重复性可达85%-95%,适合多样本间的甲基化差异分析;

    3. 检测范围广:全基因组水平鉴定甲基化区域

    五.常见问题

    1. 全基因组甲基化(WGBS)的测序原理是什么?

    全基因组甲基化测序的重要步骤是前期样本的重亚硫酸盐处理,可将所用未甲基化的C(胞嘧啶)转化为U(尿嘧啶),而CpG序列中已被甲基化的C不受影响,在随后的PCR反应中,UT(胸腺嘧啶)替代,至此,重亚硫酸盐处理的甲基化序列得以分析。

    2. 全基因组甲基化的测序深度为多少?

    为了进行全基因组水平的甲基化分析, 建议测序深度为物种基因的大小的30-50倍。

    3. 全基因组甲基化(WGBS)相对于其他甲基化测序的优势在哪?    

    目前DNA甲基化测序的主要有WGBSMeDIPRRBS,其中MeDIP无法达到单碱基甲基化的分辨率,而RRBS一般选择甲基化程度较高的区域进行分析,无法获得全基因水平的甲基化状态。


  • 利用VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系统鉴定

    1. 服务概述

        VITEK 2 COMPACT是生物梅里埃公司集合多年的微生物方面的经验,推出的最新微生物鉴定、药敏智能系统。其微生物鉴定功能是基于微生物鉴定“金标准”-API基础上设计的。既能够进行细菌鉴定到种又可以同时做药敏实验。共有7种微生物鉴定卡片,可鉴定1200多种微生物。更适合用于出入境检验检疫、疾病控制和防疫、食品安全、制药、质量监督部门、企业、兽医、渔业水产养殖等微生物实验室。 

    提供的VITEK 2 Compact 30全自动细菌鉴定及药敏分析系统技术服务,主要包括:微生物的菌种鉴定,细菌的药敏实验等

     

    2. 服务要求

    1)需新近的且足量的材料(现场采集的呕吐物、粪便等),或直接提供纯化好的菌种

    2)通过电话、邮件等形式说明材料的类型或类型,进行微生物鉴定或药敏实验

     

    3. 服务流程

    1)通过电话、邮件等形式说明材料的类型,进行微生物鉴定、药敏实验或二者同时进行

    2)制定技术服务方案

    3)签订实验技术服务合同,支付预付款

    4)进行微生物鉴定或药敏实验

    5)分析实验结果

    6)提供完整的实验报告

     

    4. 实验周期

    1)微生物鉴定经过纯化的菌种2-18h(酵母菌鉴定大约需18h),未纯化的材料(现场采集的呕吐物、粪便等)3-5

    2)药敏实验经过纯化的菌种5-8h,纯化的材料(现场采集的呕吐物、粪便等)3-5

     

    5. 实验操作流程

    1)菌种分纯,扩大培养

    2)已纯化的菌种做菌悬液,选择卡片(鉴定或药敏),上机实验

    3)查看并分析实验结果

    4)得出完整的实验报告

     

     

    利用VITEK  MS 微生物质谱鉴定系统鉴定

    1. 服务概述:

        VITEK MSVITEK Mass SpectrometryVITEK 质谱仪),采用MALDI-TOF技术(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)用于临床微生物包括普通细、厌氧菌、苛养菌、酵母样真菌、丝状真菌、分支杆菌、支原体、霉菌等的快速鉴定。可鉴定菌种(3.0版数据库),共1056种,其中细菌892种,真菌(酵母+霉菌)164种。

     

    2. 服务要求

    1)需新近的且足量的材料(现场采集的呕吐物、粪便等),或直接提供纯化好的菌种

    2)通过电话、邮件等形式说明材料的类型或类型

     

    3. 服务流程

        1)通过电话、邮件等形式说明材料的类型,进行微生物鉴定、药敏实验或二者同时进行

        2)制定技术服务方案

        3)签订实验技术服务合同,支付预付款

        4)进行微生物鉴定或药敏实验

        5)分析实验结果

        6)提供完整的实验报告

     

    4. 实验周期

    1)微生物鉴定经过纯化的菌种10min,未纯化的材料(现场采集的呕吐物、粪便等)3

    2)药敏实验经过纯化的菌种5-8h,纯化的材料(现场采集的呕吐物、粪便等)3-5

     

    5. 实验操作流程

    1)菌种分纯,扩大培养

    2)微生物鉴定,单菌落涂靶板;药敏实验已纯化的菌种做菌悬液,选择卡片(药敏),上机实验

    3)用MALY服务器同时查看并分析鉴定和药敏实验结果

    4)得出完整的实验报告

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